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021-65232515
產品型號:
所屬分類:分子生物學實驗
產品時間:2024-08-30
簡要描述:基因克隆[平臺項目開展范圍]慢病毒,腺病毒,RNAI類, 分子生物實驗,病理實驗,免疫學實驗,細胞實驗,動物實驗,蛋白組學實驗,芯片類實驗,并為廣大客戶朋友們提供課題設計指導、基金申請指導、SCI. 核心期刊等服務。
基因克隆
一.目的基因的獲得
目的基因是指所要研究或應用的基因,也就是將要克隆或表達的基因。獲得目的基因是分子克隆過程中重要的一步。目前用于獲得目的基因的方法有幾種,如限制性內切酶直接分離法、文庫篩選法、體外擴增法和人工合成法等,其中限制性內切酶法直接分離目的基因和多聚酶鏈式反應(PCR) 或逆轉錄多聚酶鏈式反應(RT-PCR) 體外擴增目的DNA*—片段是目前*&常用的方法。
(一)采用限制性酶切法直接分離目的基因
1、從原核基因組中制備原核基因組相對較小,用幾種限制性內切酶分別消化原核基因組,或用某種限制性內切酶對所要研究的基因組進行部分消化,可以得到大小不等的各種片段,其中有些片段就會含有目的基因,將這些片段插入載體中進行克隆,經過篩選,可以得到所需的目的基因。
2.從真核基因組中制備真核基因組比較大,直接用限制性內切酶消化后需要篩選的克隆數(shù)太多,不易操作??梢杂靡环N限制性內切酶先消化基因組DNA,產生連續(xù)的DNA--片段,然后電泳分離這些DNA--片段,再用-段特異探針與這些DNA--片段進行雜交,在含有特異性模板的區(qū)域就會出現(xiàn)雜交帶,可以初步鑒定基因組中是否含有目的基因。我們也可以將酶切后的基因組DNA--片段全部克隆入適當?shù)妮d體中,制成基因組文庫,再用特異性探針與基因組文庫中的不同克隆進行雜交,陽性克隆即示克隆到的DNA--片段含有特異基因序列。將陽性克隆測序,用第yi個克隆片段的末端分離下一個克隆片段,然后利用DNA--片段間的重疊順序來鑒定其他克隆。這樣一步步走下去,終可得全部基因序列,這種技術叫做染色體步移(chromosome walking)。
(二)采用PCR或RT-PCR方法制備目的基因
1.根據(jù)已發(fā)表的基因序列設計并合成引物,采用PCR (以基因組DNA為模板)或RT-PCR (以mRNA為模板)從組織或細胞中獲取目的基因片段用于基因操作,這是實驗室中#*常用的獲取已知基因的方法。
2.利用PCR獲取目的基因的一大優(yōu)點就是可以根據(jù)需要在引物序列上設計適當?shù)拿盖形稽c起始密碼子或終止密碼子等,或通過人為錯配改變堿基序列(人工突變)對目的基因進行有限修飾。對于未知基因,可采取構建RT-PCR文庫的方法獲得未知基因:利用mRNA末端poly A序列尾設計共用引物,將所有mRNA逆轉錄成cDNA.利用各種工具酶在cDNA末端加尾,然后采用一-對共用引物擴增所有cDNA--片段,將經PCR擴增后的片段插入到適當載體中,構建成PCR-CDNA文庫。這種方法的優(yōu)點是可以將表達水平很低的mRNA擴增出來,有利于篩選出表達豐度低的基因。由于經過PCR擴增,基因序列的精&*確性需要采用其他方法進一步確定。
3.還有一個獲得目的基因的方法是利用計算機技術進行計算機克隆。即利用GenBank中的基因信息,通過軟件比較不同種屬基因之間的相似性(同源性),利用保守區(qū)序列設計引物, 再用PCR或RT-PCR從不同種屬或不同組織細胞中獲取未知的基因片段。這是目前可實現(xiàn)的一種獲得新基因的捷徑。
(三)基因組文庫或cDNA文庫的構建和篩選
1.將基因組DNA用限制性內切酶消化后插入到適當載體中,得到含有不同插入片段的克隆載體,這種克隆載體的混合物含有長短不同的基因組片段,這就是基因文庫。若將細胞內所有mRNA均逆轉錄成cDNA,然后將所有cDNA--片段克隆到適當?shù)妮d體中,構建成含有不同cDNA--片段的克隆載體混合物,這就是cDNA文庫。目前許多組織或細胞的基因組或cDNA文庫都可以從商業(yè)公司買到。
2.當獲得了基因組文庫或cDNA文庫,可以根據(jù)已知的信息合成特異性探針,采用核酸分子雜交的方法從文庫中篩選感興趣的基因片段,這仍是目前獲得新基因的一種常用手段。基因組文庫或cDNA文庫的構建和使用請參見本書相應的章節(jié)。
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